自定义 | 货号 | 价格 |
---|---|---|
20T | R09055 | ¥850.00 |
50T | R09056 | ¥1500.00 |
100T | R09057 | ¥2599.00 |
R09055 | Y187 | 20T | 850 |
R09056 | Y187 | 50T | 1500 |
R09057 | Y187 | 100T | 2500 |
Y187 化学转化感受态细胞产品说明书
基因型
MATα, ura3-52, his3-200, ade
2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ,MEL1
产品说明
Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂,双杂实验用菌株,MATα型,可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株 (Y2HGold,AH109等)通过mating操作进行筛库试验。Transformation
marker为: trp1, leu2,报告基因为:lacZ,MEL1。Y187-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD (来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白;质粒pGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白
(Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域
(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive
gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成 bait融合蛋白
(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和
prey发生相互作用,就会促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。Y187有两个报告基因:lacZ,MEL1,分别由两种不同的启动子 (G1,M1)启动,这两种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。Y187感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取100 µl冰上融化的Y187感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴,重复一次)10 µl,PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O
400 µl 重悬,离心 30s弃上清。
4. ddH2O
50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y187酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为27-30℃;高于31℃,生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的Adenine被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破坏,Adenine合成途径受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中间产物P-ribosylamino
imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂YPDA平板29℃,48 h培养可见直径1 mm克隆;涂SD单缺平板29℃,48-60 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD双缺平板29℃,60-80 h培养可见直径1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90
h培养可见直径1 mm克隆。
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