自定义 | 货号 | 价格 |
---|---|---|
20T | R09052 | ¥850.00 |
50T | R09053 | ¥1500.00 |
100 | R09054 | ¥2599.00 |
R09052 | AH109 | 20T | 850 |
R09053 | AH109 | 50T | 1500 |
R09054 | AH109 | 100T | 2500 |
AH109 化学转化感受态细胞说明书
基因型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MEL1
GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
产品说明
AH109菌株来源于PJ69-2A 酵母菌株,将lacZ报告基因引入PJ69-2A诞生了AH109,此菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株,MATa型,可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为:trp1,leu2,报告基因为:lacZ,HIS3,ADE2,MEL1。AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1,用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒pGADT7的筛选标志为LEU,用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域
(DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive
gene的上游激活序列UAS,并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成 bait融合蛋白(bait
–BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和
prey发生相互作用,就会促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。AH109有四个报告基因:lacZ,HIS3,ADE2,MEL1,分别由三种不同的启动子 (GAL1,GAL2,MEL1)启动,这三种启动子只有GAL4识别的17 bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。AH109感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取100 µl冰上融化的AH109感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴,重复一次) 10 µl,PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3. 5000 rpm离心 40 s弃上清,ddH2O 400 µl 重悬,离心 30s弃上清。
4. ddH2O 50 µl重悬,涂板,29℃培养48-96 h。
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