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菌种鉴定报告

发布日期:2017-01-07

1 材料与方法

1.1 材料

Taq EP0402 Fermentas

DNA片段胶回收试剂盒AP-GX-50 Axygen

pGEM-T 货号A3600 Promega

LB培养基   购于上海生工

氨卡青霉素钠   购于上海生工

1.2 主要仪器

PCR仪器   ABI 9700PCR

电泳仪    BioRad

高速离心机  Thermo

高压灭菌锅   SANYO全自动高压灭菌锅

移液器     Thermo

1.3 方法

1.3.1 菌落PCR

使用27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1497RGGTTACCTTGTTACGACTT 进行扩增,引物为南京金斯瑞生物科技有限公司合成,储存浓度为100μm,使用浓度为10μm。按照如下方法混合各种PCR反应溶液:Buffer(Kcl) 2.5μl, 2mMdNTPs 2.5μl27F 2μl , 1497R 2μl, 25Mm MgCl2 1.5μl, Taq 0.5μl, ddH2O 14μl. 混合后用10μl的吸头撰取菌液在混和液中搅动一下,然后进行PCR

PCR反应参数如下:94℃ 4min; 94℃ 30s50℃ 30s72℃ 2min30循环; 72℃ 10minPCR结束后,1%琼脂糖鉴定,并使用Axygen AP-GX-50 DNA片段胶回收试剂盒回收PCR片段。

 

1.3.2 T载体连接

T载体连接PCR回收片段,按照如下混合:

2×Rapid Buffer 5μl, T载体 1μl, 片段 3μl, T4 DNA Ligase 1μl. 混合后室温1小时。

1.3.3 转化

100μlJM109感受态细胞,冰上解冻,取10μl的连接产物混入,冰上静置30min,然后42℃热击90s,迅速放入冰山静置5min,加入LB培养基,37℃ 150rpm 培养1小时,然后涂布于LA(含50μg/mL的氨卡青霉素钠),37度培养过夜,第二天菌落PCR鉴定阳性克隆。

1.3.4 阳性克隆鉴定

分别挑取一定数量的克隆,采用菌落PCR方法进行PCR鉴定(方法见1.3.1),同时用LA培养基培养每个克隆。鉴定结果用1%的琼脂糖鉴定,取能PCR出阳性片段的克隆送测序

1.3.5 测序比对

     使用网络服务器http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的Blastn进行比对。


2 结果

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