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His标签纯化介质产品说明书

发布日期:2017-01-07

Ni Bestarose 6Fast Flow

Ni Bestarose High Performance

1、简介

    琼脂糖亲和介质(Ni)是将金属离子Ni2+螯合在琼脂糖凝胶上形成的一种亲和层析介质,具有吸附容量大、选择型好、易于再生、成本低等优点,广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质及多肽的分离纯化,尤其是组氨酸标记蛋白质的高效纯化。                                                                                                                                                                                   

2、介质性质

●   琼脂糖浓度

6%

●   介质平均颗粒

34μm ( Ni Bestarose High Performance) 90μmNi Bestarose 6 Fast Flow

●   功能基团

Ni2+

●   结合载量

40mg His标签蛋白/ml介质

●   建议pH范围

3-12(工作),2-14(短期)

●   推荐流速

150cm/h(最大)

●   化学稳定性

40 ℃放置一周:0.01M HCl0.1M NaOH

12h1M NaOH70%乙酸;

●   存放条件

4-30℃

●   运输与储存溶液

20%乙醇                                                                                                                                                                                                  

3、建议实验条件

3.1 结合、清洗缓冲液的选择

适用于His标签纯化过程的缓冲液首选磷酸盐缓冲液,pH范围在中性(7-8之间),避免适用EDTA及柠檬酸盐。

结合缓冲液需要含有低浓度的咪唑,这可以减少宿主蛋白同介质的非特异结合,同时样品中也要加入相同浓度的咪唑。

清洗缓冲液中含尽可能高的咪唑浓度可以增加重组histidine-tagged蛋白的纯度,但是该浓度条件下,不能把histidine-tagged蛋白洗脱下来

3.2 样品的准备

在层析过程中,需要准备符合层析要求的样品溶液。

样品缓冲液应尽可能与结合缓冲液 一致。固体样品可用结合缓冲液溶解配制;低浓度样品溶液可用结合缓冲 透析;高浓度样品溶液可用结合缓冲液稀释。重组histidine-tagged蛋白以包涵体的形式表达,可以在缓冲液中加入6M盐酸胍或8M尿素。当使用盐酸胍或尿素时,蛋白会解折叠,在柱上或洗脱后蛋白解折叠,这取决于不同的蛋白为了避免堵塞层析柱,样品应经离心或微滤(0.45μm或者是0.22μm)处理。

3.3 洗脱

3.3.1 可通过提高咪唑的浓度进行洗脱。

3.3.2 可降低缓冲液的pH进行洗过,当缓冲液pH降低至4以下时,金属离子会同介质解离从而达到洗脱目的。(如果目的蛋白对低pH敏感,建议洗脱液中加入1/10体积的1M Tris-HClpH9.0进行中和

3.3.2 螯合剂EGTAEDTA可将金属离子同介质解离而达到洗脱目的,洗脱产物中的Ni2+可用脱盐柱去除。介质可用0.1M NiSO4再次饱和后使用。

4、应用举例

例一:

图一  Ni-FF分离纯化His标签蛋白

层析柱:EzFast 1 ml

样品:大肠杆菌BL21裂解液上清

结合缓冲液:20mM PB 0.5 M NaCl 20mM咪唑, pH 7.6

洗脱缓冲液:20mM PB 0.5 M NaCl 500mM咪唑, pH 7.6

5、稳定性

    His标签介质在所有常用缓冲液中保持稳定。若要长期保存,需要浸泡在20%乙醇中并储藏于4-8℃条件下。

6、再生和在位清洗(CIP

    6.1 再生

    6.1.12-5倍介质体积脱镍缓冲液(50mM PB300mM NaCl100mM EDTA,pH 8.0)过柱子;

    6.1.25-10倍介质体积0.5M NaOH过柱,适当调整流速,保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min以上;

    6.1.310倍介质体积去离子水洗柱;

    6.1.43倍介质体积0.5M NaAC pH4.0缓冲液平衡柱子;

    6.1.53倍介质体积0.1M NiSO4过柱;

    6.1.63倍介质体积0.5M NaAC pH4.0缓冲液洗柱;

    6.1.75倍介质体积平衡缓冲液平衡柱子。

6.2 在位清洗

    6.2.1除去因离子交换作用吸附的蛋白,用2-3倍柱床体积的2M NaCl溶液清洗柱子,再用平衡缓冲液清洗柱子;

    6.2.2除去蛋白沉淀、疏水性蛋白,用1M NaOH100cm/h的流速清洗柱子1h

    6.2.3除去强的疏水性蛋白和脂质等,用4倍柱床体积的70%乙醇或者30%异丙醇洗柱子,再用平衡缓冲液平衡柱子。

7、储存

His标签纯化介质保存在含有20%乙醇溶液中,4-8℃下长期保存。

 

 

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